Анализ ПЦР – современный и высокоточный метод диагностики, позволяющий выявлять возбудителя инфекции независимо от стадии патологии. На сегодня этот способ обследования признан наиболее достоверным, так как он исключает получение ложных данных благодаря высокому уровню специфичности.

Суть метода ПЦР

Анализ ПЦР – полимеразная цепная реакция , позволяющая многократно увеличить объем микробной среды и определить возбудителя. Явление ПЦР было открыто в 20 веке американским ученым Кэри Мюллисом, благодаря которому в разы сократилось время постановки точного диагноза, а следовательно, врачи стали быстрее назначать адекватные терапевтические мероприятия.

Суть анализа ПЦР заключается в многократном увеличении фрагментов ДНК возбудителя, полученного из биологических проб пациента (мочи, крови, слюны и других). Эта методика позволяет увеличить в искусственной среде определенные участки генетического материала при помощи специальных ферментов, к тому же количество исследуемых фрагментов растет до такой степени, что можно их визуально исследовать.

Стоит отметить, что при анализе ПЦР копируются только определенные участки, играющие важную роль в диагностике. Если они присутствуют в организме пациента в ничтожно малом количестве, то этот анализ сможет их выявить.

Методика ПЦР активно используется в медицинской практике для изучения инфекционных и наследственных заболеваний, ведь помимо простого увеличения количества генетического материала (амплификации), он позволяет сращивать отдельные фрагменты ДНК и вводить мутации, осуществляя контроль за генами, которые вызывают опасения.

Что выявляет анализ ПЦР

Анализ ПЦР широко применяется в различных сферах медицины. Конечно, чаще всего он используется в гинекологии и урологии, но методика актуальна и для пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, онкологии и других областей.

Анализ ПЦР позволяет выявить вирусы на различных стадиях заболевания, также он способен выявить скрытые или «спящие» микроорганизмы, которые не вызывают появления клинических признаков:

Вирус папилломы человека разных типов (ВПЧ);
Хламидии;
Трихомонады;
Возбудителя гонореи;
Микоплазмы;
Уреаплазмы;
Гарднереллы;
Грибы кандида;
Микробактерии туберкулеза;
Вирусы гепатита А, В и С;
Хеликобактерии;
Вирусы герпеса;
Цитомегаловирусы (ЦМВ);
Вирусы Эпштейна-Барра.

Преимущества анализа ПЦР

Высокая точность анализа: риск получения ложноотрицательных результатов минимален;
Специфичность методики: анализ ПЦР позволяет выделить конкретный возбудитель инфекции, его вид и тип;
Повышенная чувствительность: анализ ПЦР определяет даже несколько фрагментов ДНК микроорганизма;
Возможность исследования разных биологических сред организма;
Скорость получения результатов: их можно получить через 4-5 часов после процедуры;
Возможность выявления нескольких микроорганизмов из одной пробы биологического материала.

Анализ ПЦР активно используется врачами разных специальностей, при этом отодвигаются на второй план другие методы диагностики. Стоит отметить, что эта процедура позволяет выявить носителей инфекции и латентные формы болезни, при которых нет клинических проявлений, но эти возбудители негативно отражаются на общем состоянии организма и его функциональности, а пациенты представляют опасность для окружающих.

Подготовка и проведение анализа ПЦР

Фрагменты ДНК микроорганизмов находятся в разных биологических средах пациента. Врачи сами определяют области взятия материалов для анализа ПЦР, которые зависят от типа заболевания и его локализации. Если вы обратились к венерологу с целью выявления инфекций, передающихся половым путем (ИППП), то будут исследованы выделения из половых органов (мазок или соскоб с шейки матки, влагалища) и мочеиспускательного канала, а также кровь и моча.

Герпетические инфекции и мононуклеоз диагностируются на основании анализа мазков из полости рта пациента. ЦМВ подтверждается после обследования мочи, спинномозговой жидкости. В отделении пульмонологии для анализа ПЦР берут мокроту и содержимое плевральной полости. У беременных при подозрении на внутриутробные инфекции плода исследуют околоплодные воды и ткани плаценты.

Чтобы исключить вероятность ошибочных результатов и повысить точность анализа ПЦР, перед сдачей биологического материала следует придерживаться несложных рекомендаций:

Большая часть микробов вымывается вместе с мочой, поэтому перед взятием мазка из уретры не стоит мочиться;
В течение 3-5 суток следует воздержаться от половых отношений;
Анализ ПЦР не проводится сразу после прекращения менструальных выделений, следует подождать 5-7 дней;
За 4 часа до сдачи слюны необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов и пищи, а перед процедурой рекомендуется прополоскать рот водой и провести легкий массаж в области щек;
Мочу следует собирать в утренние часы в стерильный контейнер, для исключения загрязнения материала перед его взятием следует подмыться, женщинам ввести стерильный тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть складку крайней плоти;
За сутки до сдачи материала надо воздержаться от приема алкоголя, острой пищи и горячих процедур (сауны, бани и т.п.);
За 2 недели до анализа ПЦР необходимо прекратить прием антибактериальных средств;
За неделю до обследования приостанавливают использование интимных гелей, мазей и вагинальных свечей.

Это довольно простые правила, но они помогут получить максимально достоверные результаты и снизить риск ошибок в диагностике.

Расшифровка анализа ПЦР

Результаты анализа ПЦР могут быть положительными или отрицательными. Отрицательный результат исследования свидетельствует об отсутствии инфекции в биологических материалах.

Положительный результат подтверждает наличие микроорганизмов, но для постановки точного диагноза необходимы сведения об их количестве. Ведь в нашем организме присутствуют условно-патогенные микробы, которые становятся причинами заболеваний только в результате активного роста и размножения. Основываясь на количественных данных анализа ПЦР, врач может выяснить стадию развития патологического процесса, его активность, подобрать специфическое лекарственное средство и его дозировку.

Анализ ПЦР во время беременности

Беременность – это особенный период в жизни каждой женщины. В это время многие ИППП или латентные инфекции могут быть крайне опасными для малыша и вызвать преждевременные роды, выкидыш, пороки и аномалии развития. Поэтому анализ ПЦР проводят всем беременным в плановом порядке преимущественно на ранних сроках (до 12 недель), но иногда назначают и во время 2 триместра.

Материал берут из канала шейки матки и уретры, процедура безболезненная и не представляет угрозы. В большинстве случаев, анализ ПЦР проводят по поводу хламидий, уреаплазм, микоплазм, цитомегаловируса, герпеса и ВПЧ. Именно эти микроорганизмы представляют угрозу во время беременности. Но иногда женщины проходят комплексный анализ ПЦР, который включается в себя исследование на большое количество микроорганизмов (12 и более).

ПРИНЦИП МЕТОДА (молекулярно-биологическая основа)

Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике.

Принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Polymerase chain reaction (PCR)) был разработан Кэри Мюллисом (фирма “Cetus”, США) в 1983г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе Госсанэпиднадзора (генотипирование, диагностика инфекционных заболеваний).

В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Естественная репликация ДНК включает в себя несколько стадий:

1) Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК);

2) Образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей)

Данный процесс можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителей инфекционных заболеваний.

Открытие термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus , оптимум работы которой находится в области 70-72°С, позволило сделать процесс репликации ДНК циклическим и использовать его для работы in vitro. Создание программируемых термостатов (амплификаторов), которые по заданной программе осуществляют циклическую смену температур , создало предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной клинической диагностики. При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза.

Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определеннных стартовых блоках- коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Таким образом, ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК- полимеразой.

Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК)

Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлиннение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК).

Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента)
Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов, сначала получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции (RT), катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).

Для получения достаточного количества копий искомого характеристического фрагмента ДНК амплификация включает несколько (20-40) циклов.

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах

1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95°C в течение 30-40 сек.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существет своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время отжига -20-60 сек.

3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). (см.рис.2). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n-число циклов амлификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

СТАДИИ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР - АНАЛИЗА

В основе метода ПЦР, как инструмента лабораторной диагностики инфекционных заболеваний лежит обнаружение небольшого фрагмента ДНК возбудителя (несколько сот пар оснований), специфичного только для данного микроорганизма, с использованием полимеразной цепной реакции для накопления искомого фрагмента.
Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа:

1. Выделение ДНК (РНК) из клинического образца

2. Амплификация специфических фрагментов ДНК
3. Детекция продуктов амплификации

Выделение ДНК (РНК)
На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций , и получение раствора ДНК или РНК, свободной от
ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации.
Выбор методики выделения ДНК(РНК) в основном определяется характером обрабатываемого клинического материала.

Амплификация специфических фрагментов ДНК
На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. В большинстве методик определения специфических фрагментов генома используется т.н. “классический вариант направленной ПЦР. Для повышения специфичности и чувствительности анализа в некоторых методиках используется метод “гнездной” (nested) ПЦР, в котором используются 2 пары праймеров (“внешние” - для 1 стадии, и “внутренние” - для 2-ой стадии).

Детекция продуктов амплификации
В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образущий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле.

В качестве альтернативы электрофоретическому методу детекции, имеющему некоторые недостатки: субъективность чтения результатов, ограничения по определению ДНК различных микроорганизмов в одной реакции, могут быть предложены гибридизационные схемы детекции. В этих схемах образующийся в результате амплификации фрагмент ДНК гибридизуется (образует 2-х цепочечные комплексы - "гибриды") со специфическим олигонуклеотидным зондом. Регистрация таких комплексов может быть проведена колориметрически или флуориметрически. В НПФ "Литех" созданы наборы для детекции на основе гибридизации с флуориметрической регистрацией результатов

ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний:

- Прямое определение наличия возбудителей

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся прдуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

- Высокая специфичность
Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает
возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

- Высокая чувствительность
Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими,
микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток).

-Универсальность процедуры выявления различных возбудителей
Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагносцировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

- Высокая скорость полученоя результата анализа
Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4.5 часа.

Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.)

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В ПРАКТИЧЕСКОМ ЗДРАВООХРАНЕНИИ

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний.

Наиболее эффективно и экономически обоснованно использование метода в:

урогинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции;

в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза;

в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза;

в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В,С и G;

в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Содержание

Тем, кто интересуется новыми способами диагностики, следует узнать, что такое метод ПЦР. Современные технические возможности в области лабораторных исследований предоставляют возможность выявлять множество заболеваний на начальных стадиях. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) считается на данный момент самым точным и новым методом.

Анализ методом ПЦР

ПЦР анализ - что это такое? Это метод использует принципы молекулярной биологии. Для исследования материала применяются особые ферменты, которые многократно и быстро копируют ДНК, РНК фрагменты возбудителей болезни. Существует разные виды ПЦР анализа в зависимости от исследуемого материала (кровь, моча, кал и т.д.). После обработки сотрудники лаборатории сравнивают с базой данных полученный результат, выявляют концентрацию, тип возбудителя.

Анализ на ПЦР помещают в специальный амплификатор (прибор), который нагревает и охлаждает пробирки с биоматериалом. Изменения температуры нужны для репликации фрагментов. Точность результата будет зависеть от точности температурного режима. Метод полимеразной цепной реакции помогает выявить:

инфекционный мононуклеоз;
цитомегаловирусную инфекцию;
вирусные гепатиты G, C, B, A;
инфекции/заболевания, передающиеся половым путем (ИППП/ЗППП): гарднереллез, трихомониаз, уреаплазмоз;
герпетическую инфекцию;
онкогенные вирусы;
листериоз;
хеликобактерную инфекцию;
клещевой энцефалит, боррелиоз;
туберкулез;
кандидоз.

Крови

На данный момент из-за новизны технологии анализ крови методом ПЦР все еще имеет высокую цену. Для подготовки биоматериала не нужно соблюдать определенные требования. Даже вызванные физическими нагрузками, стрессами, сменой рациона питания изменения состава не влияют на результат исследования. ПЦР анализ крови может испортить только прием антибактериальных средств, поэтому перед сдачей необходимо выдержать паузу между лечением и тестом.

ПЦР исследование крови – самый распространенный вариант диагностики хронических, острых инфекционных патологий при вирусном или атипичном проявлении. Серологические методы исследования имеют определенную трудность при проведении – определение наличия возбудителя проводится по наличию антител в организме человека. Результат мог быть ложноотрицательным, если состояние больного не давало время для их выработки.

Мазка

В сфере гинекологии для исследования наличия инфекционных микроорганизмов используют ПЦР анализ мазка. Работа с материалом проводится по тому же принципу, что и с кровью: многократное увеличение фрагментов ДНК возбудителя, чтобы с легкостью его идентифицировать. Это же помогает обнаружить скрытые инфекции у женщины. Для проведения анализа могут быть взяты разные биологические жидкости: слюна, мокрота, моча, кровь. В гинекологии для точности определения чаще используется мазок со слизистой влагалища из цервикального канала.

Для проведения ПЦР существуют определенные показания. Нередко его нужно сделать, чтобы выявить устойчивый к антибиотикам вид возбудителя. У женщин основными показаниями для диагностики по этому методу выступают:

беременность, которая протекает тяжело;
острая фаза ИППП;
если есть подозрение на переход ИППП в хроническую стадию;
поиск причин бесплодия.

Кала

Для выявления инфекции может быть назначен со стороны врача анализ кала на ПЦР. Для того, чтобы получить максимально достоверные результаты после теста, необходимо придерживаться следующих правил перед забором биоматериала:

за несколько суток прекратить прием слабительных препаратов: масла, свечи;
исключить медикаменты, которые дают специфическую окраску калу, к примеру, с содержанием железа.

Мочи

При необходимости для проведения теста врач может взять для исследования мочу. Высокая точность открывает возможность работать с любой биологической жидкостью, из которой удается извлечь ДНК вируса. Чтобы сдать анализ мочи ПЦР, нужно придерживаться таких ограничений перед забором материала:

минимум за 1 день до процедуры прекратить половые контакты;
за 3 недели до сдачи должно быть окончено любое антибактериальное лечение, потому что медикаменты смажут картину;
сдавать анализ нужно натощак (жидкость тоже запрещена);
брать нужно первую утреннюю порцию материала.

Результаты анализов ПЦР

Из вышенаписанного понятно, что такое ПЦР анализ и видны явные преимущества такого метода исследования. Еще один плюс данной диагностической процедуры – простота расшифровки результатов. Учитывая, сколько делается анализ ПЦР (сам процесс занимает около 5 часов, но лаборатория выдает данные через 1-2 суток), данный метод диагностики становится лучшим вариантом для определения множества инфекций. По результатам врач может сказать вам, что тест:

Отрицательный – в исследуемом материале не было искомого возбудителя.
Положительный – были найдены РНК, ДНК возбудителя.

Иногда проводится количественное определение микроорганизмов. Это необходимо при заболеваниях, которые вызывают условно-патогенные возбудители. Особенность этих вирусов в том, что проявляются они только при избыточном количестве и найти их обычными исследованиями крайне проблематично. Этот фактор важен для выбора терапевтической тактики, чтобы эффективно лечить вирусные инфекции, к примеру, гепатит, ВИЧ.

На 12 инфекций

Чтобы понять до конца, что такое ПЦР диагностика инфекций и насколько она эффективна, нужно узнать, что она способна выделять до 12 возбудителей. Проводится текст только в лабораторных условиях. Для исследования применяют специальные ферменты, которые увеличивают во много раз количество РНК, ДНК фрагментов вируса. Анализ ПЦР на 12 инфекций способен выявить:

микобактерии туберкулеза;
цитомегаловирус;
гепатит C, G, B, A;
герпес 1, 2 типа;
вирус Эпштейн-Барра (инфекционный мононуклеоз);
инфекции, которые передаются половы путем, к примеру, хламидии;
листериоз;
кандидозную инфекцию;
хеликобактер пилори;
боррелиоз, клещевой энцефалит.

На гепатит С

Этот диагностический метод помогает определить наличие вируса в крови. Это дает врачам возможность говорить о его наличии или отсутствии. Анализ ПЦР на гепатит С бывает двух видов: качественный и количественный. Первый вариант указывает только на его наличие и может иметь формулировку «обнаружен»/«не обнаружен». Этот вид теста имеет чувствительно в 10-500 МЕ/мл. Это говорит о том, что при низком содержании возбудителя в организме анализ будет «не обнаружено».

Количественный анализ более точный и покажет концентрацию инфекции в крови. Обозначается этот показатель как «вирусная нагрузка», измеряется в количестве вирусной РНК на конкретный объем крови. Расшифровка в разных лабораториях может отличаться. Помимо измерения в МЕ/мл используются единицы измерения «копии». Пересчитать копии на МЕ можно по формуле: 1 МЕ = 4 копии. Если в расшифровке значение присутствие вируса превышает 800 000 МЕ/мл (или 800*103), это говорит о высоком содержании возбудителя.

На туберкулез

Делать тест следует в утреннее время. Это важно для того, чтобы не дать всему массиву мокроты, который образовался за ночь, выйти из желудка. Анализ ПЦР на туберкулез так же важен как ИФА, Манту, томографе. Тест помогает выделить наличие микобактерий, состояние мочи, общий иммуноглобулин, СОЭ, определить состояние легких на данный момент. Для точности получения результатов при анализе ПЦР необходимо проводить его с соблюдением следующих правил:

Осуществляется посев 3 раза, но полную аспирацию содержимого желудка следует проводить только в условиях стационара.
Выявляет микобактерии посев наличествующих масс в желудке менее чем в 50% диагнозов. Даже при получении оптимальных условий рекомендуется вместо них УЗИ.
Даже при отрицательном характере результата не может быть полностью исключена вероятность развития туберкулеза с изменением СОЭ, иммуноглобулина или других показателей.
Посев материалов при ПЦР менее восприимчив на патологические состояния, если получен он в рамках бронхоскопического обследования, который исключает подозрения на ТБ у ребенка.

На ВИЧ

Для многих людей данный диагноз считается смертельным приговором. По этой причине после частых половых связей человек становится более внимателен к сигналам, которые подает его тело (а иногда придумывает их). Самый надежный вариант получить подтверждение или опровержение данного заболевания – ПЦР анализ на ВИЧ. Тест можно использовать для определения следующих возможных проблем со здоровьем:

Опровержение/подтверждение наличия ВИЧ в период серонегативного кона.
Определение генотипа ВИЧ-1, ВИЧ-2.
Уточнение описания патологического процесса при сомнительном результате иммуноблота.
Заражение после переливания крови.
Определения ВИЧ-статуса у детей, которые родились от матерей-носителей заболевания.
Помогает установить наблюдение за вирусной загруженностью организма.

На ВПЧ

Вирус папилломы может быть выявлен у любого человека, долгое время он может находиться в латентном состоянии. Развитие провоцирует ослабление иммунитет, стрессы или эмоциональные всплески. Анализ ПЦР на ВПЧ помогает определить концентрацию вируса в крови. По этой причине рекомендуется проводить количественно определение, а не качественное. Эти данные помогут спрогнозировать вероятность развития злокачественного характера инфекции.

Методика диагностики наличия ВПЧ основывается на основном свойстве ПЦР выделять из материала ДНК вируса. Из-за высокой чувствительности теста даже небольшое количество бактерий будет обнаружено. Количественное исследование открывает врачам возможность установить степень опасности заболевания, составить прогноз на будущее. Эта диагностика обязательна для всех мужчин и женщин, которые обнаружили у себя кондиломы. Количественный анализ ПЦР поможет определить, что послужило причиной развития ВПЧ: временное снижение иммунитета или хроническое заболевание.

На герпес

Данный вид диагностики в микробиологии помогает с высокой точностью проводить анализ ПЦР на герпес. Копирование фрагментов ДНК вируса будет происходить только, если в материале присутствует нужный ген. В данном случае тест по результатам проведения может указать на наличие или отсутствие возбудителя. Выявить его удастся даже при низкой концентрации в крови.

Еще один плюс анализа ПЦР в том, что он может определить герпетическую вирусную инфекцию сразу же после заражения, до появления клинической симптоматики. Можно определить тип герпеса (1 или 2), для сдачи анализа специфической подготовки не требуется, но врачи рекомендуют перед забором крови отказаться от:

жареного;
острого;
алкоголя;
жирного.

При беременности

При вынашивании ребенка очень важно провести данное исследования, чтобы поставить на учет состояние женщины. ПЦР анализ при беременности входит в перечень самых эффективных методов определения наличия разнообразных заболеваний. Провести тест нужно не только для выявления патологий, но и для определения вероятности заражения ребенка внутриутробно. Только благодаря ПЦР-диагностики стало возможным выявить степень прогрессирования, развитие множества инфекций внутри утробы матери.

Сдача анализов ПЦР

Если вам интересно, как берут анализ ПЦР, то следует рассматривать каждый отдельный случай, учитывая тип биоматериала. Соскоб, мазок или забор крови имеет свои особенности, к примеру:

плазма сдается утром;
моча берется только первая утром, в лабораторных условиях в стерильный контейнер;
мазок или соскоб будет показателен только после воздержания от половых контактов не менее 3 суток;
нельзя сдавать мазок во время менструации и через 2 суток после нее.

Где сдать анализы на ПЦР

Данный вид исследования относится к современным и высокотехнологическим способам диагностики. Сдавать анализы методом ПЦР следует в лабораториях, которые обладают всем необходимым комплексом для получения полноценных результатов. Не меньшую роль играют квалифицированные, подготовленные кадры. Отдайте предпочтение крупными, серьезным, известным лабораториям. Это поможет не только получить результаты быстро, но и обеспечит их достоверность.

Цена

Еще один вопрос, который часто интересует пациентов: сколько стоит анализ ПЦР? Из-за новизны метода, необходимости приобретения дорогостоящего оборудования цена на тест относительно высокая. На стоимость ПЦР влияет вид инфекции, на которую будут проверять человека. Ориентировочная цена и сроки выполнения тестов следующая:

ИППП проверят за 1 день, цена – 400-500 рублей.
Герпес, ВПЧ, вирус Эпштейна-Барра, цитомегловирус выявляют за сутки, цена – 300-500 р.
Анализ на гепатит проводится за 5 дней, цена на качественный вариант – 500 р., количественный – 2000 р.
Хеликобактер пилори выявляют за сутки, цена – 400 р.
Антигены, антитела ВИЧ, цена – от 380 р.
Качественный анализ РНК ВИЧ, цена – от 3 500 р.
Количественный анализ РНК ВИЧ, цена – от 11 000 р.

Видео

Внимание! Информация, представленная в статье, носит ознакомительный характер. Материалы статьи не призывают к самостоятельному лечению. Только квалифицированный врач может поставить диагноз и дать рекомендации по лечению, исходя из индивидуальных особенностей конкретного пациента.

Нашли в тексте ошибку? Выделите её, нажмите Ctrl + Enter и мы всё исправим!

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Суть метода ПЦР. ДНК-полимераза

Полимеразная цепная реакция - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале. Такой процесс увеличения числа копий ДНК называется амплификацией . Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом - полимеразой. ДНК-полимераза(Рис. 3) - фермент, участвующий в репликации (амплификации ДНК в живых организмах) ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент "читает" и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведется считывание.

ДНК-полимераза добавляет свободные нуклеотиды к 3"-концу собираемой цепочки. Это приводит к удлинению цепочки в направлении 5"-3". Ни одна из известных ДНК-полимераз не способна создать цепочку "с нуля": они в состоянии лишь добавлять нуклеотиды к уже существующей 3"-гидроксильной группе. По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере - короткой последовательности нуклеотидов (чаще 20-25), комплементарной концевым участкам изучаемого гена - к которому она могла бы добавить первый нуклеотид. Праймеры состоят всегда из оснований ДНК и РНК, при этом первые два основания всегда РНК-основания. Праймеры синтезируются другим ферментом - праймазой . Еще один фермент - геликаза - необходим для раскручивания двойной спирали ДНК с формированием одноцепочечной структуры, которая обеспечивает репликацию обеих цепочек в соответствии с полуконсервативной моделью репликации ДНК.

Некоторые ДНК-полимеразы обладают также способностью исправлять ошибки во вновь собираемой цепочке ДНК. Если происходит обнаружение неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад, исключает из неправильный нуклеотид из цепочки, затем вставляет на его место правильный, после чего репликация продолжается в обычном режиме.

Проведение ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий. Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента. (Пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 15 до 30 п. н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.)

Термостабильная ДНК-полимераза. Полимераза, используемая в ПЦР, должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза) и другие.

Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ионы Mg 2+, необходимые для работы полимеразы.

Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции - pH, ионную силу раствора. Содержит соли, сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если же используется прибор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.

Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов:

1 . Денатурация, или "плавление" ДНК. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96?С (или до 98?С, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом , он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

2. Отжиг - связывание праймеров с матричной ДНК . Когда цепи разошлись, температуру медленно понижают, чтобы парймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается 50-65?С. Время стадии - 20 - 60 секунд. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифичных продуктов (при заниженной температуре).

3. Синтез (элонгация цепи). ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве "затравки". Полимераза начинает синтез второй цепи от 3"-конца праймера, который связался с матрицей и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72?С. Время синтеза зависит от типа ДНК-полимеразы и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации , чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7 - 10 минут.

В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.

Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически.

Чтобы понять, как именно происходит амплификация определенного сегмента ДНК в ходе ПЦР, нужно четко представить положение всех праймеров и комплементарных им последовательностей в амплифицируемых цепях в каждом раунде. В первом раунде каждая из новосинтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3" -гидроксильной группы ее праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Такие цепи называют "длинными матрицами", именно на них будет идти дальнейший синтез.

Во втором раунде двухцепочечную ДНК, состоящую из сходной и новосинтезированной (длинная матрица) цепей, опять подвергают денатурации, а затем отжигают с праймерами. Во время синтеза в этом раунде вновь синтезируются "длинные матрицы", а также некоторое количество цепей с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймеру, на другом ("короткие матрицы"). Во время третьего раунда все гетеродуплексы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплицируются. В последующих раундах "коротких матриц" становится все больше, и к 30-му раунду их число уже в 10 6 раз превышает число исходных цепей или "длинных матриц".

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2 n , где n - число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100%, поэтому в действительности:

где Р - количество продукта, Е - средняя эффективность цикла.

Число "длинных" копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов.

ПЦР - высокочувствительный метод, поэтому при наличии в исследуемом образце даже ничтожного количества ДНК, случайно попавшей из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду.

Основные принципы подбора праймеров.

При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:

1. Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют 3"-концам праймеров, т.к именно с них начинает достраивать комплементарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно, синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе в виде тяжелых или легких дополнительных полос. Это мешает оценке результатов реакции, т.к легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

2. Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т.е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом.

Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов.

Впервые этот метод разработал К. Мюллис (США) в 1983 т. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и простоте выполнения его широко применяют в генетике, судебной медицине, диагностике и других областях.

Суть метода - амплификация, т. е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплементарности. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин-тимин и гуанин-цитозин.

ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймер - это фрагмент ДНК, состоящий из 20-30 нуклеотидов. Эти праймеры (затравки) комплементарны противоположным цепям ДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК.

Обычно ПЦР ставят в 25-40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первый - денатурация при 92-95 °С. При этом две цепи ДНК расходятся; второй - отжиг, или присоединение праймеров при 50-65 °С; третий - элонгация, или полимеризация при 68-72 °С, при этом ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов. В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т. д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом, идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов насинтезировать миллионы (2 n) фрагментов ДНК - количество, достаточное для индикации их различными методами (методом гибридизационных зондов, содержащих определенную метку, электрофорезом и т. д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных только для определенного возбудителя.

Методика постановки ПЦР сводится к следующему: из исследуемого материала выделяют ДНК-матрицу; в пробирке соединяют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую входят ДНК-полимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров, MgCl, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду возбудителя. Результаты регистрируют чаще методом электрофореза в 1-2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня.

С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: гнездовую ПЦР; ПЦР с «горячим стартом» с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами. Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.

В настоящее время внедряется новая технология ПЦР-ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальная особенность - мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить предъявляемые к ПЦР требования лаборатории. ПЦР в реальном времени используют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способа детективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

Система детекции продукта в полимеразной цепной реакции «real-time» (мониторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплифицированной ДНК. Система включает и себя олигонуклеотидный зонд, который способен присоединяться (гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5′-конце зонд помечен флуоресцентным красителем-репортером (reporter dye), а на 3′-конце - блокатором (quencher dye). По мере накопления продукта ПЦР зонд гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором. В результате копирования последовательности полимераза достигает 5′-конца зонда. 5’-3′-экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 3′-конца пробы, тем самым освобождая флуоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала, что и приводит к увеличению флуоресценции. Уровень флуоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции. Важно, что результаты ПЦР регистрируются по наличию флуоресценции в закрытых пробирках и, таким образом, решается еще одна из основных проблем этого метода - проблема контаминации ампликонами.

Достоинства ПЦР: быстрота анализа; высокие чувствительность и специфичность; минимальное количество исследуемого материала; простота в исполнении и возможность полной автоматизации.

Ввиду того что чувствительность ПЦР может достигать до детекции одной копии ДНК-матрицы, существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов. Поэтому генно-диагностической лабораторией при постановке ПЦР необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы.

ПЦР является одним из дополняющих методов, существующих в вирусологической диагностике. Эта реакция очень важна для диагностики вирусных инфекций, когда вирусные антигены или вирусспецифические антитела не могут быть обнаружены и когда присутствие вирусной нуклеиновой кислоты может быть единственным свидетельством заражения, особенно при латентно протекающих и смешанных инфекциях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .